如何使用牛津杯做抑菌试验/药敏实验（杯碟法）

抑菌试验/药敏实验方法主要有两种，即扩散法和稀释法。其中扩散法属手工测试方法，通过测试药物纸片或者牛津杯在固体培养基上的抑菌圈的大小，判断细菌对该种药物是否敏感。稀释法包括试管稀释法和微量稀释法，通过测试细菌在含不同浓度药物培养基内的生长情况，判断其最低抑菌浓度（MIC）。

由于扩散法操作简单，成本低，已经被大多数实验室和基层单位所采用。扩散法又包括纸片法、牛津杯法和打孔法。

一、实验原理

1、将培养基平板置培养箱中培养，一方面试验菌（指示菌）开始生长繁殖；另一方面抗生素呈球面扩散，形成递减的梯度浓度，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。

2、在牛津杯周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。

3、抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度（药敏实验）或药物对指示细菌的抑菌程度（抑菌试验）。

4、抗生素浓度越高，抑菌圈越大。

5、在抑菌圈的边缘处，琼脂培养基中所含抑菌物质的浓度即为该菌悬液中对该种指示菌的最低抑菌浓度（MIC） 。

6、抑菌圈直径与药物对测试菌的最低抑菌浓度 呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。

二、实验材料

培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基

菌种：大肠杆菌（E.coli)、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)

药品：阿莫西林、黄芪多糖、

其他：牛津杯、培养皿、酒精棉、酒精灯、涂布器、移液枪、1mL、200uL枪头、恒温培养箱、超净工作台、接种环

三、实验操作

1. 倒平板：将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，每皿约20ml，凝固。

2. 标记：菌种、牛津杯摆放位置、药物及其 浓度

3. 制备菌悬液：用生理盐水洗下试管内的菌苔并稀释。

4. 菌液涂布：吸取1mL 菌液入平板表面，用涂布器涂布将菌液涂布均匀

5. 摆放牛津杯：在培养基表面垂直摆放牛津杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。

6.加入待检药液：在杯中加入不同稀释度的药液或待检样品。

7. 孵育：加满后在37 ℃培养16~18 h。

8. 结果报告：用毫米尺量取抑菌圈直径，参考表的标准判读结果，按敏感（S）、中介（I）、耐药（R）报

以牛津杯周围没有肉眼可见生长物区域为抑菌圈，根据抑菌圈直径大小判断细菌对抗菌药的敏感性。

抑菌试验结果判定标准：抑菌圈直径（毫米）

＞20极敏感

15-20高敏感

10-14中敏感

＜10低敏感

 0不敏感

四、注意事项

1.         在超净工作台中或酒精灯旁操作

2.         平板倒好，一定要平

3.         牛津杯立直，才能保证杯内抑菌物质均匀的向四周扩散

4.         牛津杯均匀摆放于培养基上，位置安排适中，防止出现抑制圈重叠，可在平皿中央摆一个，外周等距离摆5－6个。